Polje biotehnologija je ena stalnih sprememb. Hitra rast in razvoj vrhunskih raziskav sta odvisna od inovativnosti in ustvarjalnosti znanstveniki in njihova sposobnost, da v osnovni molekularni tehniki vidijo potencial in ga uporabijo na novem procesov. Pojav verižne reakcije polimeraze (PCR) odprla mnoga vrata v genetskih raziskavah, vključno s sredstvi za DNK analiza in identifikacija različnih genov na podlagi njihovih sekvenc DNA. Zaporedje DNK je odvisno tudi od naše zmožnosti uporabe gel elektroforeza ločiti verige DNA, ki se razlikujejo po velikosti za samo en osnovni par.
Zaporedje DNK
V poznih sedemdesetih letih so izumili dve tehniki zaporedja DNK za daljše molekule DNK: metodo Sanger (ali dideoksi) in metodo Maxam-Gilbert (kemično cepitev). Maxam-Gilbertova metoda temelji na cepljenju s kemikalijami, specifičnem za nukleotide, in se najbolje uporablja za zaporedje oligonukleotidov (kratki nukleotidni polimeri, običajno dolžine manj kot 50 baznih parov). Metoda Sanger se pogosteje uporablja, ker je tehnično lažje dokazana in s pomočjo Pojav PCR in avtomatizacija tehnike se zlahka nanese na dolge niti DNK, vključno z nekaterimi celimi geni. Ta tehnika temelji na prekinitvi verige z dideoksinukleotidi med reakcijami raztezanja PCR.
Sanger metoda
Pri metodi Sanger se nit verige DNA, ki jo je treba analizirati, uporabi kot predloga, DNA polimeraza pa se v reakciji PCR uporablja za ustvarjanje komplementarnih verig z uporabo prajmov. Pripravljene so štiri različne reakcijske zmesi PCR, vsaka vsebuje določen odstotek analogov dideoksinukleozid trifosfata (ddNTP) v enem od štirih nukleotidov (ATP, CTP, GTP ali TTP).
Sinteza novega verige DNK se nadaljuje, dokler se ne vključi eden od teh analogov, v tem času pa se veriga prezgodaj skrajša. Vsaka reakcija PCR bo vsebovala mešanico različnih dolžin DNK, vse pa se konča z nukleotidom, ki je bil za to reakcijo označen z dideoksi. Gel elektroforeza nato se uporablja za ločevanje pramenov štirih reakcij v štirih ločenih stezah in določanje zaporedja izvirne predloge na podlagi, katere dolžine pramenov se končajo s kakšnim nukleotidom.
V avtomatizirani Sangerjevi reakciji se uporabljajo temeljni premazi, ki so označeni s štirimi različnimi barvnimi fluorescenčnimi oznakami. Reakcije s PCR v prisotnosti različnih dideoksinukleotidov izvajamo, kot je opisano zgoraj. Vendar se nato štiri reakcijske zmesi združijo in nanesejo na en sam pas gela. Barva vsakega fragmenta zazna z laserskim žarkom, informacije pa zbira računalnik ki ustvari kromatograme, ki prikazujejo vrhove za vsako barvo, iz katerih je lahko zaporedje DNK predloge odločen.
Običajno je metoda samodejnega sekvenciranja natančna le za sekvence do dolžine največ 700-800 baznih parov. Vendar pa je mogoče dobiti celotne sekvence večjih genov in pravzaprav celih genomov z uporabo postopnih metod, kot sta Primer Walking in Shotgun zaporedje.
V Primerni hoji je izvedljiv del večjega gena sekvenciran po metodi Sanger. Novi primerji nastanejo iz zanesljivega segmenta sekvence in se uporabljajo za nadaljevanje sekvenciranja dela gena, ki je bil zunaj dosega prvotnih reakcij.
Zaporedje puško vključuje naključno rezanje zanimivega dela DNK na primernejše (obvladljive) fragmente velikosti, zaporedje vsakega fragmenta in urejanje kosov na podlagi prekrivanja sekvence. To tehniko so olajšali z uporabo računalniške programske opreme za urejanje prekrivajočih se kosov.