Omejevalni endonukleazi so razred encim ki režejo molekule DNK. Vsak encim prepozna edinstveno zaporedje nukleotidov v verigi DNK - običajno približno štiri do šest baznih parov. Zaporedja so palindromna, saj ima komplementarni niz DNK isto zaporedje v obratni smeri. Z drugimi besedami, oba niza DNK sta razrezana na istem mestu.
Kje se najdejo ti encimi
Restriktivni encimi najdemo v številnih sevih bakterij, kjer je njihova biološka vloga sodelovati pri obrambi celic. Ti encimi omejujejo tujo (virusno) DNK, ki vstopi v celice tako, da jih uniči. Gostiteljske celice imajo sistem za spremembo omejitve, ki metilira lastno DNK na mestih, specifičnih za njihove restriktivne encime, in jih tako zaščiti pred cepitvijo. Več kot 800 znanih encimov odkrili so več kot 100 različnih nukleotidnih sekvenc.
Vrste restrikcijskih encimov
Obstaja pet različnih vrst restrikcijskih encimov. Tip I razreže DNK na naključnih mestih največ 1.000 ali več baznih parov od mesta prepoznavanja. Tip III odreže približno 25 baznih parov od mesta. Obe ti vrsti zahtevata ATP in sta lahko velika encima z več podenotami. Encimi tipa II, ki se pretežno uporabljajo v biotehnologiji, razrežejo DNK znotraj prepoznanega zaporedja brez potrebe po ATP in so manjši in enostavnejši.
Omejitveni encimi tipa II so imenovani glede na bakterijske vrste, iz katerih so izolirani. Encim EcoRI je bil na primer izoliran iz E. coli Večina javnosti je poznana z E. izbruhi coli v hrani.
Omejevalni encimi tipa II lahko ustvarijo dve različni vrsti rezov, odvisno od tega, ali obrežeta oba prameni v središču prepoznavnega zaporedja ali vsak pramen bližje enemu koncu prepoznavanja zaporedje.
Prejšnji rez bo ustvaril "tuje konce" brez nukleotidnih previsov. Slednji ustvarijo "lepljive" ali "kohezivne" konce, ker ima vsak nastali fragment DNA previs, ki dopolnjuje ostale fragmente. Obe sta uporabni v molekularni genetiki za izdelavo rekombinantna DNA in beljakovine. Ta oblika DNK izstopa, ker nastane z ligacijo (vezanjem) dveh ali več različnih niti, ki prvotno niso bili povezani.
Encimi tipa IV prepoznajo metilirano DNK, encimi tipa V pa uporabljajo RNA za rezanje sekvenc na invazivnih organizmih, ki niso palindromni.
Uporaba v biotehnologiji
Omejevalni encimi se v biotehnologiji uporabljajo za rezanje DNK na manjše niti, da bi preučili razlike v dolžini fragmentov med posamezniki. Temu rečemo polimorfizem dolžine restriktivnih fragmentov (RFLP). Uporabljajo se tudi za kloniranje genov.
RFLP tehnike so bili uporabljeni za določitev, da imajo posamezniki ali skupine posameznikov izrazite razlike v genskem zaporedju in vzorcih cepitve restrikcij na določenih območjih genoma. Poznavanje teh edinstvenih področij je osnova za DNK prstni odtis. Vsaka od teh metod je odvisna od uporabe elektroforeza gela z agarozo za ločitev fragmentov DNK. Pufer TBE, ki ga sestavljajo tris baza, borova kislina in EDTA, se običajno uporablja za agarozni gel elektroforeza za pregled izdelkov DNK.
Uporaba pri kloniranju
Kloniranje pogosto zahteva vstavljanje gena v plazmid, ki je vrsta koščka DNK. Omejitveni encimi lahko pri postopku pomagajo zaradi enojnih verig, ki jih pustijo, ko se režejo. DNA ligaza, ločen encim, lahko združita dve molekuli DNK z ujemajočimi se konci.
Torej, z uporabo restrikcijskih encimov z encimi DNA ligaze lahko kosov DNK iz različnih virov uporabimo za ustvarjanje ene same molekule DNK.