PCR pomeni polimerazna verižna reakcija, molekularna biološka tehnika za pomnoževanje segmentov DNK z ustvarjanjem več kopij z uporabo encimov DNA polimeraze v nadzorovanih pogojih. V milijone kopij je mogoče klonirati samo eno kopijo segmenta ali gena DNA, kar omogoča odkrivanje z barvili in drugimi tehnikami vizualizacije.
Proces PCR, razvit leta 1983, je omogočil izvedbo Sekvenciranje DNK in identificirati vrstni red nukleotidov v posameznih genih. Metoda uporablja termično kroženje ali ponavljajoče segrevanje in hlajenje reakcije za taljenje in razmnoževanje DNK. Medtem ko se PCR nadaljuje, se "nova" DNA uporablja kot predloga za replikacijo in nastane verižna reakcija, ki eksponentno pomnoži predlogo DNK.
Tehnike PCR se uporabljajo na številnih področjih biotehnologije, tudi proteinski inženiring, kloniranje, forenzika (odvzem DNK), testiranje očetovstva, diagnoza dednih in / ali nalezljivih bolezni ter za analiza okoljskih vzorcev.
Zlasti za forenzike je PCR koristen, ker povečuje tudi najmanjšo količino dokazov DNK. PCR lahko uporabimo tudi za analizo DNK, ki je stara več tisoč let, te tehnike pa se uporabljajo za identifikacijo vsega, od 800.000 let starega mamuta do mumij z vsega sveta.
Postopek PCR
Inicializacija
Ta korak je potreben samo za DNK polimeraze, ki potrebujejo PCR z vročim zagonom. Reakcijo segrejemo na temperaturo med 94 in 96 ° C in držimo 1-9 minut.
Denaturacija
Če postopek ne zahteva inicializacije, je denaturacija prvi korak. Reakcijo segreva na 94-98 ° C 20-30 sekund. Vodikove vezi v predlogi DNK so pretrgane in nastanejo enodročne molekule DNK.
Žarjenje
Reakcijska temperatura je nižja med 50 in 65 ° C in je zadržana 20-40 sekund. Primeri se sprožijo z enodročno šablono DNK. V tem koraku je temperatura izredno pomembna. Če je prevroče, se lahko temeljni premaz ne veže. Če je prehladno, se lahko temeljni premaz veže nepopolno. Dobra vez nastane, ko zaporedje temeljnega premaza natančno ustreza zaporedju predloge.
Podaljševanje / podaljševanje
Temperatura v tem koraku se razlikuje glede na vrsto polimeraze. DNK polimeraza sintetizira popolnoma nov sklop DNK.
Končni raztezek
Ta korak se izvaja pri 70-74 ° C 5-15 minut po končnem ciklu PCR.
Končni zadržek
Ta korak ni obvezen. Temperatura se vzdržuje pri 4-15 ° C in reakcija preneha.
Tri stopnje postopka PCR
Eksponentna ojačitev
Med vsakim ciklom se izdelek (specifični del DNK, ki se podvaja) podvoji.
Stopnja izravnave
Ko DNK polimeraza izgubi aktivnost in porabi reagente, se reakcija upočasni.
Planota
Izdelek se ne nabira več.