TBE pufer (Tris-borat-EDTA) je puferska raztopina, sestavljena iz baze Tris, borove kisline in EDTA (etilendiaminetetraocetne kisline). Ta pufer se pogosto uporablja za elektroforezo gela z agarozo pri analizi produktov DNK, ki so rezultat amplifikacije PCR, protokolov za čiščenje DNK ali poskusov kloniranja DNK.
Uporaba TBE
TBE pufer je še posebej uporaben za ločevanje manjših fragmentov DNK (MW <1000), kot so majhni produkti restrikcijski encim prebavi. TBE ima večjo zmogljivost puferja in bo daljal ostrejšo ločljivost kot pufer TAE. TAE (Tris-acetat-EDTA) pufer je raztopina, sestavljena iz baze Tris, ocetne kisline in EDTA.
TBE je na splošno dražja od TAE in zavira ligazo DNA, kar lahko povzroči težave, če bodo predvideni nadaljnji koraki čiščenja in ligacije DNA. S tremi preprostimi koraki, ki sledijo, se naučite, kako narediti pufer TBE. Za ustvarjanje ne bi smelo trajati več kot 30 minut.
Kaj rabiš
Za izdelavo puferja TBE boste potrebovali samo štiri snovi. Preostali predmeti na tem seznamu so oprema. Štiri potrebne snovi so dinatrijeva sol EDTA, baza Tris, borova kislina in deionizirana voda.
Kar zadeva opremo, boste potrebovali pH meter in kalibracijske standarde, če je to primerno. Poleg tega boste želeli nekaj 600-mililitrskih in 1500-mililitrskih čašic ali bučk. Zaokrožitev potreb po opremi so diplomirani valji, mešalne palice in mešalne plošče.
Preverite zalog v laboratoriju, ki ga boste uporabljali, in se prepričajte, da imate vse, kar potrebujete, preden začnete. Nič hujšega od tega, da se morate vmes pripraviti na rešitev, ker vam je zmanjkalo ustreznih materialov.
Če je vaš laboratorij v šoli ali na vašem delovnem mestu, preverite s primernim osebjem in preverite, ali imajo vse izdelke na zalogi. S tem boste lahko na koncu prihranili čas in energijo.
Teža formule je skrajšano kot FW. To je atomska teža elementa, pomnožena s številom atomov vsakega elementa v formuli, nato pa seštejemo vse mase vsakega elementa skupaj.
Zaloga rešitve EDTA
Pred časom je treba pripraviti rešitev EDTA. EDTA ne bo šel popolnoma v raztopino, dokler se pH ne naravna na približno 8,0. Za 500-mililitrsko osnovno raztopino 0,5 M EDTA odtehtamo 93,05 gramov dinatrijeve soli EDTA (FW = 372,2). Nato ga raztopite v 400 mililitrih deionizirane vode in nastavite pH z NaOH (natrijevim hidroksidom). Po tem raztopino dolijte do končne prostornine 500 mililitrov.
Zaloga TBE
Naredite koncentrirano (5x) osnovno raztopino TBE s tehtanjem 54 gramov baze Tris (FW = 121,14) in 27,5 gramov borove kisline (FW = 61,83) in se raztopijo v približno 900 mililitrih deioniziranih voda. Nato dodajte 20 mililitrov 0,5 M (molarnost ali koncentracija) EDTA (pH 8,0) in raztopino prilagodite končnemu volumnu 1 litra. To raztopino lahko hranite pri sobni temperaturi, vendar se v starejših raztopinah oborina tvori. Tamper shranite v steklene steklenice in ga zavrzite, če je nastala oborina.
Delovna rešitev TBE
Za elektroforezo z agarozo v gelih lahko uporabimo pufer TBE s koncentracijo 0,5x (razredčenje koncentracije 1:10). Osnovno raztopino razredčite 10-krat v deionizirani vodi. Končne koncentracije topil so 45 mM tris-borata in 1 mM (milimolarna) EDTA. Predpomnilnik je zdaj pripravljen za uporabo v izvajanje agaroznega gela.