Kako polimerazna verižna reakcija deluje za pomnoževanje genov

Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je molekularno genetska tehnika za izdelavo več kopij gena in je tudi del procesa sekvenciranja genov.

Kopije genov so narejene z uporabo vzorca DNK, tehnologija pa je dovolj dobra, da naredi več kopij iz ene same kopije gena, najdenega v vzorcu. PCR pomnoževanje gena za izdelavo milijonov kopij omogoča odkrivanje in identifikacijo genskih sekvenc z uporabo vizualnih tehnik, ki temeljijo na velikosti in naboju (+ ali -) kosa DNK.

V nadzorovanih pogojih majhne segmente DNK tvorijo encimi, znani kot DNK polimeraze, ki dodajo komplementarne deoksinukleotide. (dNTP) na del DNK, znan kot "predloga". Tudi manjši deli DNK, imenovani "primeri", se uporabljajo kot izhodišče za polimeraza.

Primerji so majhni umetni deli DNK (oligomeri), običajno dolgi od 15 do 30 nukleotidov. Nastanejo s poznavanjem ali ugibanjem kratkih zaporedij DNK na samih koncih gena, ki se pomnožuje. Med PCR se sekvencirana DNK segreje in dvojne verige se ločijo. Po ohlajanju se temeljni premazi vežejo na šablono (imenovano žarjenje) in ustvarijo prostor za začetek polimeraze.

Polimerazno verižno reakcijo (PCR) je omogočilo odkritje termofilnih in termofilnih encimi polimeraze (encimi, ki ohranjajo strukturno celovitost in funkcionalnost po segrevanju pri visoki temperaturi temperature). Koraki, vključeni v tehniko PCR, so naslednji:

• Ustvarjena je zmes z optimiziranimi koncentracijami DNK predloge, encima polimeraze, primerjev in dNTP. Sposobnost ogrevanja mešanica brez denaturacije encima omogoča denaturacijo dvojne vijačnice vzorca DNK pri temperaturah v območju 94 stopinj Celzija.
• Po denaturaciji se vzorec ohladi na zmernejše območje, okoli 54 stopinj, kar olajša žarjenje (vezavo) primerjev na enoverižne DNK predloge.
• V tretjem koraku cikla se vzorec ponovno segreje na 72 stopinj, idealno temperaturo za Taq DNA polimerazo, za raztezanje. Med elongacijo DNK polimeraza uporablja prvotno eno verigo DNK kot predlogo za dodajanje komplementarnih dNTP na 3' konce vsakega primera in ustvariti odsek dvoverižne DNK v regiji zanimivega gena.
• Primerji, ki so žarjeni z zaporedji DNK, ki se ne ujemajo natančno, ne ostanejo žarjeni pri 72 stopinjah, kar omejuje raztezanje na gen, ki nas zanima.

Ta proces denaturacije, žarjenja in raztezevanja se ponovi večkrat (30-40) krat, s čimer se eksponentno poveča število kopij želenega gena v mešanici. Čeprav bi bil ta postopek precej dolgočasen, če bi ga izvajali ročno, je mogoče vzorce pripraviti in inkubirati v a Programabilni Thermocycler, ki je zdaj običajen v večini molekularnih laboratorijev, in popolno reakcijo PCR je mogoče izvesti v 3-4 ure.

Vsak korak denaturacije ustavi proces raztezanja prejšnjega cikla, s čimer se nova veriga DNK skrajša in ohrani na približno velikosti želenega gena. Trajanje cikla raztezka se lahko podaljša ali skrajša, odvisno od velikosti gena, ki nas zanima, vendar sčasoma s ponavljajočimi se cikli PCR bo večina predlog omejena na velikost gena, ki nas zanima, saj bodo ustvarjene iz produktov obeh temeljni premazi.

Obstaja več različnih dejavniki za uspešno PCR ki jih je mogoče manipulirati za izboljšanje rezultatov. Najbolj razširjena metoda za testiranje prisotnosti produkta PCR je elektroforeza v agaroznem gelu. Ki se uporablja za ločevanje fragmentov DNK glede na velikost in naboj. Fragmente nato vizualiziramo z uporabo barvil ali radioizotopov.

Od odkritja PCR so bile odkrite DNA polimeraze, ki niso izvirne Taq. Nekateri od teh imajo boljšo sposobnost "lektoriranja" ali so bolj stabilni pri višjih temperaturah, s čimer se izboljša specifičnost PCR in zmanjšajo napake zaradi vstavljanja napačnega dNTP.

Nekatere različice PCR so bile zasnovane za posebne aplikacije in se zdaj redno uporabljajo v molekularno genetskih laboratorijih. Nekatere od teh so PCR v realnem času in PCR z reverzno transkriptazo. Odkritje PCR je pripeljalo tudi do razvoja sekvenciranja DNK, DNK prstni odtis in druge molekularne tehnike.