RFLP in aplikacije za analizo DNK

Polimorfizem dolžine omejevalnega fragmenta (RFLP) je molekularna metoda genetske analize, ki omogoča prepoznavanje posameznikov na podlagi edinstvenih vzorcev restrikcijski encim rezanje v določenih regijah DNK.

Tehnologija, imenovana tudi RFLP analiza, izkorišča prednosti polimorfizmi v genetskih kodih posameznih ljudi. Čeprav imajo vsi pripadniki vrste v bistvu enako genetsko sestavo, te majhne razlike predstavljajo razlike v fenotipu, kot sta videz ali metabolizem, med posamezniki.

Tehnika RFLP analize vključuje rezanje določenega območja DNK z znano variabilnostjo, z restrikcijskimi encimi, nato ločimo fragmente DNK z agarozno gel elektroforezo in določimo število fragmentov in relativne velikosti.

Restriktivni encim je encim, beljakovinska molekula, ki reže DNK na mestih restrikcije. V bistvu se vzorec DNA razgradi in prebavi s pomočjo restrikcijskih encimov. Nastali fragmenti so ločeni glede na njihove dolžine, vzorec velikosti fragmentov pa se bo razlikoval za vsakega posameznega testiranega.

Celoten postopek RFLP zahteva označevanje sonde, fragmentacijo DNK, elektroforezo, blotting, hibridizacijo, pranje in avtoradiografijo. Zaznani RFLP vizualiziramo z uporabo rentgenskega filma v avtoradiografiji, kjer si lahko fragmente DNK ogledamo in analiziramo, potem ko jih elektroforeza ločimo drug od drugega.

Nekatere aplikacije za RFLP analizo vključujejo:

• DNK prstni odtis: Forenzični znanstveniki lahko uporabljajo RFLP analizo za prepoznavanje osumljencev na podlagi vzorcev dokazov, zbranih na prizoriščih zločinov.
• Očetovstvo: RFLP se uporablja tudi pri določanju očetovstva ali za sledenje predniki.
• Genska raznolikost: Tehnika se lahko uporablja pri preučevanju evolucije in selitve prostoživečih živali, preučevanju vzrejnih vzorcev v populaciji živali ter odkrivanju in diagnosticiranju nekaterih bolezni.

Tehnika uporabe RFLP odkrivanja variacij v genomih je bistveno orodje pri kartiranju genoma in analizi genetskih bolezni. Če bi lokacijo določenega gena bolezni iskali v določenem kromosomu, bi raziskovalci to storili analizirati DNK članov družine z boleznijo, nato pa poiščite podobne vzorce dedovanja v RFLP aleli.

Ko je gen za bolezen lokaliziran, bi lahko z RFLP analizo na drugih družinskih članih razkril nosilca mutiranih genov ali nakazal skupno tveganje za bolezen. Pomembno je opozoriti, da se tehnika RFLP danes ne uporablja široko, ker se za analizo DNK v forenzični znanosti in na številnih drugih področjih uporabljajo novejše, bolj robustne tehnike.

Na žalost je tehnika RFLP analize dolgočasna in počasna. Poleg tega, da ne bi potrebovali velike količine vzorčne DNK, bi moral biti vzorec približno velikosti četrtine, kar je razmeroma veliko za vzorce DNK - postopek, od označevanja sonde do pranja in avtoradiografije, lahko traja celo mesec do dokončana.

Rezultati projekta Human Genome so precej nadomestili potrebo po RFLP. Projekt je omogočil določitev celotnega zaporedja DNK, ki ga najdemo v človeških celicah, človeškem genomu, in za identifikacijo vseh genov v človeškem genomu.