Postopek po gramovih madežih v mikrobiologiji

Barva po Gramu je različna metoda obarvanja, ki se uporablja za dodelitev bakterije v eno od dveh skupin (gram-pozitivne in gram-negativne) glede na lastnosti njihove celične stene. Znano je tudi kot barvanje po Gramu ali Gramova metoda. Postopek je imenovan za osebo, ki je razvila tehniko, danski bakteriolog Hans Christian Gram.

Kako deluje Gram madež

Postopek temelji na reakciji med peptidoglikanom v celičnih stenah nekaterih bakterij. Barva po Gramu vključuje obarvanje bakterij, določanje barve z mordantom, razbarvanje celic in nanašanje protitarka.

  1. Primarni madež (kristalno vijolična) se veže na peptidoglikan, ki obarva celice vijolično. Tako gram-pozitivne kot gram-negativne celice imajo peptidoglikan v svojih celičnih stenah, zato na začetku vse bakterije obarvajo vijolično.
  2. Gramov jod (jod in kalijev jodid) se uporablja kot mordant ali fiksativ. Gram-pozitivne celice tvorijo kristalno vijolično-jodni kompleks.
  3. Alkohol ali aceton se uporablja za razbarvanje celic. Gram-negativne bakterije imajo veliko manj peptidoglikana v svojih celičnih stenah, zato jih ta korak v bistvu postane brezbarven, medtem ko se iz gram-pozitivnih celic odstrani le nekaj barve, ki imajo več peptidoglikana (60-90% celične stene). Debela celična stena gram-pozitivnih celic dehidrira s postopkom razbarvanja, zaradi česar se skrčijo in v notranjosti zapletejo madež-jod.
    instagram viewer
  4. Po razbarvanju barve nanesemo kontrastain (navadno safranin, včasih pa fuksin), da bakterije obarvamo roza. Tako gram-pozitivne kot gram-negativne bakterije pobirajo rožnati madež, vendar ga ni mogoče videti nad temnejšo vijolično gram-pozitivno bakterijo. Če se postopek obarvanja izvede pravilno, bodo gram-pozitivne bakterije vijolične, medtem ko bodo gram-negativne bakterije rožnate.

Namen tehnike barvanja po Gramu

Rezultati madeža po Gramu so prikazani z uporabo svetlobne mikroskopije. Ker so bakterije obarvane, ni samo identificirana njihova skupina po Gramu, temveč tudi njihova oblika, velikost in vzorec lahko opazimo. Zaradi tega je madež po Gramu dragoceno diagnostično orodje za medicinsko kliniko ali laboratorij. Medtem ko madež morda ne identificira bakterij, pogosto vemo, ali so gram-pozitivni ali gram negativni, zadostujejo za predpisovanje učinkovitega antibiotika.

Omejitve tehnike

Nekatere bakterije so lahko gram-spremenljive ali gram-nedoločene. Vendar pa so celo te informacije lahko koristne za zmanjšanje identitete bakterij. Tehnika je najbolj zanesljiva, kadar so kulture stare manj kot 24 ur. Čeprav se lahko uporablja na kulturah juhe, jih je najbolje najprej centrifugirati. Primarna omejitev tehnike je, da daje napačne rezultate, če v tehniki storimo napake. Za zanesljiv rezultat sta potrebna praksa in spretnost. Tudi povzročitelj infekcije morda ni bakterijski. Evkariotski patogeni obarvajo gram-negativno. Vendar večina evkariontske celice razen gliv (vključno s kvasom) se med postopkom ne držijo drsnika.

Postopek obarvanja po Gramu

Materiali

  • Kristalna vijolična (primarni madež)
  • Gramov jod (mordant, ki fiksira kristalno vijolično v celični steni)
  • Etanol ali aceton (razmaščevalec)
  • Safranin (sekundarni madež ali kontrastain)
  • Voda v plastenki ali kapalki
  • Diapozitivi za mikroskop
  • Sestavljeni mikroskop

Koraki

  1. Na diapozitiv položite majhno kapljico bakterijskega vzorca. Toploto pritrdite bakterijam na tobogan tako, da ga trikrat preženete skozi plamen Bunsenovega gorilnika. Če vložite preveč toplote ali predolgo, lahko stopite celične stene bakterij, ki izkrivljajo njihovo obliko in vodijo do nepravilnih rezultatov. Če nanesemo premalo toplote, bodo bakterije med obarvanjem odplaknile drsnik.
  2. S kapalko nanesite primarni madež (kristalno vijolično) na diapozitiv in pustite, da sedi 1 minuto. Diapozitiv nežno sperite z vodo največ 5 sekund, da odstranite odvečni madež. Predolgo izpiranje lahko odstrani preveč barve, medtem ko ne izpirajte dovolj dolgo, lahko na gram-negativnih celicah ostane preveč madežev.
  3. S kapalko nanesite Gramov jod na diapozitiv, da kristalno vijolico pritrdite na celično steno. Naj sedi 1 minuto.
  4. Diapozitiv sperite z alkoholom ali acetonom približno 3 sekunde, takoj pa sledite z rahlim izpiranjem z vodo. Gram-negativne celice bodo izgubile barvo, gram-pozitivne celice pa bodo ostale vijolične ali modre. Če pa razbarvalec ostane predolgo, bodo vse celice izgubile barvo!
  5. Nanesite sekundarni madež, safranin in pustite, da sedi 1 minuto. Nežno sperite z vodo največ 5 sekund. Gram-negativne celice naj bodo obarvane rdeče ali roza, medtem ko bodo gram-pozitivne celice še vedno videti vijolično ali modro.
  6. Diapozitiv si oglejte s pomočjo sestavljenega mikroskopa. Za razlikovanje oblike in razporeditve celic bo morda treba povečati od 500x do 1000x.

Primeri patogenov, ki so pozitivni na gram in gram

Niso vse bakterije, ki jih identificira madež po Gramu, povezane z boleznimi, nekaj pomembnih primerov pa vključuje:

  • Gram-pozitivni kaki (okrogli):zlati stafilokok
  • Gram-negativni kaki:Neisseria meningitidis
  • Gram-pozitivni bacili (palice): Bacillus anthracis
  • Gram-negativni bacili:Escherichia coli
instagram story viewer